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    利用Ion半導體測序開展基因表達譜分析

    發(fā)布時間: 2012-11-05  點擊次數(shù): 2635次

                 研究顯示雜交芯片可產生大約兩百萬個已定位的讀取[7],但也有研究證實,即使讀取數(shù)目過億,提高讀取數(shù)目仍然繼續(xù)增加其信息量 那么,究竟Ion PGM™測序儀生成多少個100 base讀取能相當于一個基因表達微陣列芯片呢?在白皮書[9]中我們對Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays (HG-U133 Plus 2.0)的芯片質量控制(MAQC)的微陣列數(shù)據(jù)與Ion PGM™系統(tǒng)生成的RNA-Seq數(shù)據(jù)進行了比較。圖1顯示了Ion PGM™測序儀數(shù)據(jù)按照不同檢測閾值下所得的基因數(shù)和微陣列芯片所能檢測到的基因數(shù)。當采用zui嚴謹?shù)臋z測閾值即每個基因≥10讀取時,兩百萬個來自Ion PGM™測序儀的已定位讀取所能檢測到的基因數(shù)超過了微陣列芯片能檢測的基因。

                 當讀取計數(shù)閾值放寬到≥5讀段數(shù)/基因時,僅僅1百萬個Ion RNA-Seq已定位讀取所能檢測到的基因數(shù)就超過了芯片的基因檢測數(shù)。利用來自Ion PGM™測序儀的2百萬個平均讀取所能檢測到的顯著差異表達基因數(shù)(sig DEGs)要多于微陣列芯片所能檢測到的sig DEGs數(shù)。在p ≤0.05和倍數(shù)變化f≥2標準下,在HBRR和UHRR樣本中Ion PGM™測序儀得到的sig DEGs數(shù)為4,630,而相比之下芯片得到的sig DEGs數(shù)為4,198將Ion PGM™測序儀生成的兩百萬個已定位讀取所產生的基因差異表達結果與qPCR結果相比較,發(fā)現(xiàn)qPCR 和RNA-Seq得到的sigDEGs倍數(shù)變化的對數(shù)值的Pearson相關系數(shù)(R)超過0.95。

                 在Ion PGM™平臺進行RNA-Seq實驗的另一個優(yōu)勢在于,能夠應用ERCC RNA Spike-In Mix對轉錄本檢測靈敏度進行評估。這些ERCC轉錄本混合物是一些含多聚腺苷酸化且無標記的RNA,該混合物經過美國國家標準技術研究所(NIST)鑒定,是評估RNA測量系統(tǒng)性能的工具,能控制實驗可變因素。這些ERCC轉錄本的GC含量經過平衡,更貼近真核生物內源性mRNA的特征,它們的長度范圍在250 到2,000個核苷酸之間。ERCC轉錄本混合物的含量構成經特殊設計,能代表一個大動態(tài)范圍的表達水平。ERCC ExFold RNA Spike-In Mix可用于評估基因差異表達的檢測靈敏度。這些質控RNA使用戶得以直接評估文庫質量、檢測靈敏度、動態(tài)范圍以及表達倍數(shù)變化。劑量響應散點圖顯示,ERCC相對濃度的對數(shù)值與已定位讀取數(shù)的對數(shù)值呈線性關系(圖2)。利用這些外部RNA質控有助于將來自合作實驗室所產生的結果進行直接比較。

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